Μοριακές βιολογικές μεθόδους έρευνας και της χρήσης τους

Μοριακής βιολογίας μεθόδους έρευνας διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη σύγχρονη ιατρική, εγκληματολογία, και τη βιολογία. Χάρη στην πρόοδο στη μελέτη του DNA και του RNA, το άτομο είναι σε θέση να διερευνήσει το γονιδίωμα του οργανισμού καθορίζουν την αιτιολογικός παράγοντας, να αναγνωρίζουν το επιθυμητό νουκλεϊκό οξύ σε ένα μίγμα οξέων, κλπ

Μοριακή-βιολογικές μεθόδους. Τι είναι αυτό;

Επιστροφή στα 70-80s των επιστημόνων ήταν ο πρώτος για να αποκρυπτογραφήσει το ανθρώπινο γονιδίωμα. Το γεγονός αυτό έδωσε ώθηση στην ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής και της μοριακής βιολογίας. Μελέτη των ιδιοτήτων των DNA και RNA σημαίνει ότι είναι πλέον δυνατή η χρήση αυτών των νουκλεϊκών οξέων για το σκοπό της διάγνωσης ασθενειών, γονίδιο μελέτη.

Παρασκευή DNA και RNA

Μοριακές βιολογικές διαγνωστικές μέθοδοι απαιτούν υλικό έναρξης: συχνά αυτό το νουκλεϊκό οξύ. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να επιλέξετε αυτές τις ουσίες από τα κύτταρα των ζωντανών οργανισμών. Καθένα από αυτά έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του, και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή μιας μεθόδου απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων σε καθαρή μορφή.

1. Παρασκευή του DNA από Marmur. Η μέθοδος συνίσταται στην κατεργασία του μίγματος των ουσιών αλκοόλης, καθιζάνει προκύπτον καθαρό DNA. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η χρήση διαβρωτικών ουσιών, φαινόλη και χλωροφόρμιο.

2. Απομόνωση του DNA σχετικά με την έκρηξη. Η κύρια ουσία που χρησιμοποιείται εδώ - είναι θειοκυανικής γουανιδίνης (GuSCN). Προωθεί την απόθεση των δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος σε εξειδικευμένα υποστρώματα, από την οποία μπορούν να συλλεχθούν στη συνέχεια με τη βοήθεια ενός ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος. Ωστόσο GuSCN - είναι ένας αναστολέας του TCP, και ακόμη και ένα μικρό μέρος της ότι παίρνει κατατεθεί στο DNA μπορεί να επηρεάσει την πορεία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, η οποία είναι σημαντική κατά την εργασία με νουκλεϊκά οξέα.

3. Καταβύθιση των προσμείξεων. Η μέθοδος διαφέρει από τις προηγούμενες στο ότι τα μόρια ίδιοι δεν έχουν εναποτεθεί dehoksiribonukleinovoy οξύ και ακαθαρσίες. Για να το κάνετε αυτό, χρησιμοποιήστε τα εναλλάκτες ιόντων. Το μειονέκτημα είναι ότι δεν είναι όλες οι ουσίες μπορούν να εγκατασταθούν.

4. διαλογή μάζης. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις όπου δεν χρειάζεται να έχουν ακριβείς πληροφορίες σχετικά με τη δομή του μορίου του DNA, καθώς και την ανάγκη να πάρετε κάποια στατιστικά στοιχεία. Ο λόγος είναι ότι η δομή του νουκλεϊκού οξέος μπορεί να υποστεί ζημιά κατά το χειρισμό απορρυπαντικά, ιδιαίτερα αλκάλια.

Ταξινόμηση των μεθόδων έρευνας

Όλες οι μοριακές-βιολογικές μέθοδοι έρευνας χωρίζεται σε τρεις μεγάλες ομάδες:

1. Ενίσχυση (χρησιμοποιώντας μία πληθώρα ενζύμων). Αυτό περιλαμβάνει PCR - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές από τις διαγνωστικές μεθόδους.

2. Neamplifikatsionnye. Αυτή η ομάδα των μεθόδων συνδέεται άμεσα με το έργο των μιγμάτων νουκλεϊκού οξέος. Παραδείγματα είναι 3 είδη κηλίδες, ίη situ υβριδισμό, κ.τ.λ.

3. Μέθοδοι βασίζεται στην αναγνώριση του σήματος από το μόριο ανιχνευτή, το οποίο συνδέεται προς ένα ειδικό DNA ή RNA ανιχνευτή. Παράδειγμα - σύστημα υβριδισμού διαλύματος Σύστημα Capture Hybride (Hc2).

Ένζυμα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μοριακές βιολογικές μεθόδους έρευνας

Πολλές τεχνικές μοριακής διαγνωστικής περιλαμβάνουν τη χρήση ευρέος φάσματος των ενζύμων. Παρακάτω χρησιμοποιούνται πιο συχνά:

1. περιοριστικό ένζυμο - «κοπεί» το μόριο του DNA στις απαραίτητες μέρη.

2. DNA πολυμεράση - συνθέτει ένα μόριο δίκλωνου δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.

3. Αντίστροφη μεταγραφάση (ανάστροφη μεταγραφάση) - που χρησιμοποιείται για να συνθέσει DNA από ένα πρότυπο RNA.

4. DNA λιγάση - είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό των δεσμών φωσφοδιεστέρα μεταξύ νουκλεοτιδίων.

5. εξωνουκλεάση - αφαιρεί νουκλεοτίδια από τα ακραία τμήματα του μορίου δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.

PCR - η βασική μέθοδος της ενίσχυσης DNA

Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιείται ευρέως στη σύγχρονη μοριακή βιολογία. Αυτή η μέθοδος, κατά την οποία μπορεί να ληφθεί ένα απλό μόριο ΟΝΑ ένα μεγάλο αριθμό αντιγράφων (ενίσχυση μόριο).

Οι κύριες λειτουργίες του PCR:

- διάγνωση ασθενειών?

- κλωνοποίηση τμημάτων DNA, Gene.

Για τη διεξαγωγή της αντίδρασης αλύσου πολυμεράσης απαιτεί τα ακόλουθα στοιχεία: αρχική μόριο DNA, μία θερμοσταθερή ϋΝΑ πολυμεράση (Taq ή Pfu), δεοξυριβονουκλεοτίδιο φωσφορικά (πηγές βάσεις αζώτου), οι εκκινητές (2 εκκινητής 1 DNA μόριο) και το ίδιο ένα ρυθμιστικό σύστημα το οποίο μπορεί να διεξάγει όλες οι αντιδράσεις.

PCR αποτελείται από τρία βήματα: μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητών και επιμήκυνσης.

1. μετουσίωση. Σε θερμοκρασία 94-95 βαθμούς Κελσίου proshodit σπάσουν οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο αλυσίδων του DNA, και ως αποτέλεσμα έχουμε δύο μονόκλωνα μόρια.

2. ανοπτημένων εκκινητών. Σε θερμοκρασία 50-60 βαθμών Κελσίου συμβαίνει εκκινητές προσχώρηση στα άκρα των μορίων μονόκλωνου νουκλεϊκού οξέος σύμφωνα με τον τύπο της συμπληρωματικότητας.

3. Επιμήκυνση. Σε θερμοκρασία 72 βαθμών συντίθεται κόρη δίκλωνο μόρια δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.

αλληλουχίας DNA

Μοριακές βιολογικές μεθόδους έρευνας απαιτούν συχνά τη γνώση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων σε ένα μόριο δεσοξυριβονουκλεϊνικού οξέος. Για τον προσδιορισμό του γενετικού κώδικα αλληλουχία. Μοριακή διάγνωση του μέλλοντος θα βασίζεται στη γνώση που αποκτήθηκε κατά τον προσδιορισμό της ανθρώπινης αλληλουχίας.

Οι ακόλουθοι τύποι αλληλούχισης:

• αλληλούχιση από τον Maxam-Gilbert?
• αλληλούχιση Sanger?
• πυρο?
• αλληλούχιση nanoporovoe.